①模擬的灵芝建立及其顯著性檢驗對表2的試驗數據進行二次模擬回歸分析，得到三萜化合物得率（Y）對料液比（A）、发酵粉中回流時間（B）和溫度（C）的萜化提二次多項回歸方程：Y=0.67＋6.000×10^-3A-8.525×10^-3B-6.150×10^-3C-0.020AB-2.700×10-3AC-8.900×10-3BC0.056A²-0.079B²-0.031C²。其分析結果見表3。合物

由表3可知，纯化模型p＜0.0001，及结說明試驗選用的构初二次多項模型差異極顯著。失擬項p＞0.05，步分表示不顯著，灵芝即該模型對本實驗的发酵粉中擬合程度良好，可以較好地描述各因素與響應值之間的萜化提真實關係。其中R²=0.9932，合物表明自變量和響應值之間的纯化關係顯著，調整係數R²_Adj=0.9845，及结說明該模型能夠解釋98.45%的构初響應值變化，試驗誤差小，可以運用此模型對靈芝發酵粉三萜化合物提取工藝進行分析和預測。一次項A、B、C對響應值三萜得率的影響達到顯著水平，二次項A²、B²、C²對其影響極顯著，AB、BC交互作用顯著說明不同提取條件與靈芝發酵粉三萜提取得率之間不是簡單的線性關係。

②響應麵交互作用分析

為確定各因素交互作用對靈芝發酵粉中三萜化合物提取得率的影響，根據二次模擬回歸方程繪出響應麵及等高線圖，見圖7至圖9。

圖7、圖9等高線形狀為橢圓形，而圖8等高線形狀為圓形，表明料液比和回流時間、回流時間和回流溫度的交互作用顯著，料液比和回流溫度的交互作用不顯著。

③最佳提取條件確定

通過回歸方程求得優化後的三萜化合物提取條件為：料液比1∶30.66（g/mL）、回流時間2.94h，回流溫度84.53℃。為方便試驗操作，調整條件為料液比1∶30（g/mL）、回流時間3h、回流溫度85℃。驗證試驗測得三萜類化合物的平均得率為0.6760mg/g，與預測值0.6694mg/g相比誤差為0.98%，可見，通過響應麵優化得到的三萜化合物的提取條件比較可靠。

2、靈芝三萜粗提物的分離純化及結構鑒定結果

（1）靈芝三萜的高效液相色譜檢測

靈芝三萜粗提物經二次柱層析分部收集後，合並單一斑點的流分進行高效液相色譜檢測，結果見圖10。

由圖10可以看出，流動相為2%乙酸溶液∶乙睛=70∶30時，檢測出樣品中有2個峰，說明樣品中有2個不同組分，分別保留時間4.039min、4.234min。

（2）紫外光譜掃描分析

由圖11可知，該物質紫外譜圖在280nm、260nm波長處無明顯吸收峰，說明經過前期矽膠柱層析後得到的三萜類化合物比較純，基本不含有蛋白質及核酸等雜質。其最大吸值在波長237nm處，具有靈芝三萜的特征吸收峰。根據規律可得到在靈芝三萜化合物中C11位沒有羰基，在Δ^7（8）Δ^9（11）位存在共軛雙鍵，其吸收強度大多在l0gε3.7～4.1之間。

（3）紅外光譜掃描分析

由圖12可知，在3446cm-1處有一組比較寬的強吸收峰，說明存在分子間氫鍵O-H伸縮振動；1137cm^-1處有一組強吸收峰，表明該物質分子中含有羥基；在2360cm^-1處的吸收峰表明該物質中含有羧基；在1647cm^-1處有較強的吸收峰，則表明該物質中含有α、β-不飽和酮；而在1458cm^-1～1217cm^-1中的1294cm^-1、1398cm^-1處的吸收峰是多氫菲環的特征吸收峰。綜合以上分析，推斷該流分化合物為含有羥基的四環三萜化合物。
綜合以上分析，推斷該流分化合物為含有羥基的四環三萜化合物。

三、結論

采用回流提取法提取靈芝發酵粉中的三萜化合物，經單因素試驗和Box-Behnken試驗設計對該提取工藝進行優化，得到最佳工藝參數為：料液比=1∶30（g/mL）、回流時間為3h，回流溫度為85℃。在此條件下提取三萜類化合物的平均得率為0.6760mg/g。

通過矽膠柱層析分級得到1組流分，經高效液相色譜檢測，發現該組流分含有2個組分。對純化後的靈芝三萜樣品進行了紅外和紫外結構分析，確定靈芝發酵粉中其中一流分為含有羥基的四環三萜化合物，在Δ^7（8）Δ^9（11）位存在有共軛雙鍵。通過對靈芝三萜化合物提取和結構初步鑒定，不僅為產品質量檢驗提供的理論基礎，可以更好的了解其功能性。

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