2.5不同加工方式對石斛堿的药用研究影響

石斛通常以其新鮮或幹燥莖入藥，對其加工方式主要有煎煮、石斛属植榨汁、物石幹燥、斛碱潤蒸、进展粉碎以及製成各種石斛藥品或石斛保健品，药用研究如複方石斛片、石斛属植石斛夜光丸、物石石斛花茶等。斛碱不同的进展加工方式會導致石斛製品中藥效成分含量的不同。朱南南等研究發現，药用研究貴州赤水4個基地的石斛属植金釵石斛幹品和鮮品中石斛堿含量各有高低，但經過配對t檢驗處理，物石發現整體上差異不顯著；錢桂敏等研究發現，斛碱不同的进展幹燥方法對金釵石斛中石斛堿含量影響依次為冷凍幹燥法(0.45%)＞傳統烘幹法(0.43%)＞熱風循環幹燥法(0.42%)；黎恩立首次對金釵石斛進行超微粉碎加工，結果發現，超微粉和普通粉的多糖溶出率分別為0.2848g/g和0.1936g/g，而石斛堿的溶出率分別為0.0035g/g和0.0033g/g；孫芸等在小議石斛的煎煮方式時提到，石斛中的有效成分主要為難溶於水的生物堿，故為了提高石斛的臨床療效，建議在煎藥時先煎1～2h後再與其他藥一起煎煮，以免造成不必要的浪費；歐德明等研究發現，不同炮製方法對石斛堿含量的影響依次為白酒潤蒸(0.28%)＞蒸製品(0.23%)＞黃酒潤蒸(0.23%)＞黃酒炙品(0.22%)＞白酒炙品(0.22%)＞石斛幹品(0.18%)。

由此可見，酒是較好的溶劑，能顯著提高生物堿等藥用植物中多種有效成分的溶出率，因此，在對藥用石斛加工時，建議可先以酒炙方法進行炮製，以增加其有效成分的溶出率，縮短煎煮的時間。同時，使用超微粉碎技術對石斛屬植物進行加工，雖然石斛堿的得率差異不大，但是卻大大提升了石斛多糖的溶出率，而且普通粉和超微粉表現出相似的紅外光譜吸收，說明其有效成分在超微粉碎過程中並沒有被破壞，故超微粉碎技術也不失為藥用石斛屬植物的一種有效加工方式。隨著現代加工技術的不斷發展，石斛屬植物的加工方式也在不斷地進行著改進和完善，特別是其幹燥方式。建議將來可對傳統的單一加工技術以不同的方式進行組合優化，以達到生產成本與產品質量之間的穩態平衡，進一步提高中草藥植物藥用功效成分提取利用率。

3石斛堿的合成途徑

自1970年Kaneko等首次以二氫黃蒿萜酮為起始材料合成了石斛堿的三環骨架結構以來，對石斛堿的人工合成途徑報道從未間斷。王亞芸等對石斛堿的人工合成途徑進行了詳細的綜述。隨著現代科學技術的發展進步，對於石斛堿的人工合成途徑進行著不斷地完善和改進。Padwa等使用呋喃甲酸酯的IMDAF環加成/重排序列完成了(±)-Dendrobine的正式合成，將重新排列的環加合物轉化為Kende的高級中間體隻需要8個步驟；Hu等利用手性催化劑(20moL%催化劑ent-8)在甲苯中反應48h，從非手性組分的Diels-Alder反應中得到手性產物，為通過Kende反應進行(—)-Dendrobine的對映選擇性合成開辟了新的道路；Kreis等報道了一種(—)-Dendrobine的不對稱合成途徑，總共需要18步，總得率為4.0%，大大改善了以往的任何合成途徑的產量；Lee等開發了一種可以快速得到石斛堿核心結構的過渡金屬催化級聯工藝，並可避免不穩定中間體的生成；Guo等報道了一種隻需要12步(總得率：6.7%)或者11步(總得率：3.8%)對映選擇性全合成左旋石斛堿(—)-Dendrobine的方法。

20世紀70年代以來，對於石斛堿化學合成途徑的研究從未間斷，為化學合成藥物提供了較好的基礎。但是目前石斛堿發揮其藥用功效的主要途徑仍然以食用含有石斛堿的藥用石斛屬植物的新鮮或幹燥莖為主，故如何提高石斛堿在藥用石斛屬植物中的含量仍需加以關注。

朱勝男利用茉莉酸甲酯(MeJA)、水楊酸(SA)、一氧化氮供體(SNP)三種信號分子對金釵石斛組培苗進行處理，並比較測定其石斛堿含量，通過構建cDNA文庫以及采用實時熒光定量PCR技術，篩選到2個參與金釵石斛中石斛堿代謝合成途徑的關鍵酶基因：托品酮還原酶基因DnTRI和DnTRII；李金玲以石斛堿含量存在顯著差異的不同時期金釵石斛莖為樣本，進行數字基因表達譜(DGE)的測序，同時構建金釵石斛轉錄組文庫，對不同時期金釵石斛莖中的差異表達基因(DEGs)進行分析，對DEGs的數量、功能和表達模式進行比較分析，係統篩選石斛堿合成代謝途徑上的相關基因，並通過實時熒光定量PCR技術進行驗證。最終篩選出5個參與石斛堿合成途徑的關鍵酶基因：甲羥戊酸激酶(MVK)基因(Unigene1219)、賴氨酸甲基化酶基因(CL429)、異戊烯焦磷酸異構酶(IDI)基因(CL3435)、法尼基轉移酶基因(CL11407)和半胱氨酸甲基酯酶基因(CL8067)。初步提出了石斛堿的萜類合成途徑為：先按照萜類化合物形成的共同途徑至單萜［甲羥戊酸(MVA)途徑和2-C-甲基-D-赤蘚醇-4-磷酸(MEP)途徑］，再按照倍半萜途徑進行生物合成。

從植物內生菌方麵著手，研究石斛堿合成途徑也不失為一條很好的研究策略。閆浩利等研究發現，經菌根真菌MF23(Mycenasp.)處理後的組培苗石斛堿含量比對照組高15.69%。Li等結合轉錄組高通量測序以及實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈式反應(qRT-PCR)對真菌MF23影響石斛堿的作用機製進行了探究，結果顯示，與石斛堿倍半萜骨架形成相關的乙酰輔酶A酰基轉移酶(AACT)、焦磷酸甲羥戊酸脫羧酶(MVD)、磷酸甲羥戊酸激酶(PMK)和萜烯合酶(TPS21)基因在真菌MF23接種9周後表達水平發生顯著變化，推測MF23可能通過調節參與甲羥戊酸途徑的基因表達來影響石斛堿的生物合成，為石斛堿合成途徑的研究奠定了基礎。該團隊在近幾年中利用反轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)和cDNA末端快速擴增(RACE)技術，從金釵石斛中分離克隆得到3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A合酶(HMGS)基因：DnHMGS(KX789180)；3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶(HMGR)基因：DnHMGR2(KX825920)；MVD基因：DnMVD(KY626328)，並進一步研究發現，克隆到的基因均受到菌根真菌MF23的調控，為進一步解析菌根真菌MF23對金釵石斛中石斛堿合成代謝途徑調控機製奠定了研究基礎。

植物的次生代謝一般都涉及很多條轉錄因子、關鍵基因及其對應酶的相互協同表達。隨著現代生物分子技術的發展，對植物次級代謝產物合成途徑上的關鍵基因進行超表達，進而促進次生代謝產物的生成已成為研究的熱點。石斛堿基本骨架為含15個碳原子、有一個五元內酯環型倍半萜類生物堿，目前石斛堿合成途徑尚不清晰，僅見於少量對石斛堿合成途徑上關鍵酶基因相關的研究，迄今為止共篩選出11個參與石斛堿合成途徑的關鍵酶基因，對於石斛堿複雜的代謝合成途徑仍需要開展大量研究工作。

4展望

在中草藥的品種、栽培、收獲、加工以及貯存等工作程序中，隻有以中草藥有效成分的“質”和“量”為前提，才能確保中草藥應有的療效。石斛堿具有神經係統保護、清熱止痛、抗炎症、心血管保護、抗癌以及抗甲型流感病毒等藥用功效，具有很好的挖掘潛力與應用前景，但我們在關注石斛堿藥用功效的同時，也應該對其毒理性進行相關的研究，從而能夠合理、高效地發揮其藥用價值。

雖然對影響石斛中石斛堿含量的因素已有相當多的研究報道，但是也存在一定的局限性：(1)所收集的材料是否具有地區代表性有待考究；(2)大多數材料都是野生石斛，生長的年限無法得到統一控製；(3)石斛種類繁多、種質混雜，石斛品種鑒定有待進一步的考究；(4)檢測方法的不同也會對石斛堿的含量造成一定的影響。因此，目前研究結果隻能在一定程度上根據所收集的材料對不同藥用石斛屬植物的品質做出預測，為其新育種技術在一定程度上提供理論支持。目前，我國獲取中藥藥效成分的方法主要是依賴於從藥用植物中直接提取分離，但藥用植物的栽培易受產地、氣候、品種以及病蟲害等的影響，進而導致藥用活性成分產量和質量的不穩定。故應加大對石斛堿在植物體內生物合成途徑的研究力度，明確關鍵酶基因，通過基因表達調控、轉基因等手段實現其在植株中的高效合成，或者通過合成生物學技術實現石斛堿的異源生物合成，進而提高藥用石斛屬植物中石斛堿的含量，為中藥資源的可持續利用發展提供重要的科學意義和應用價值。

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