鐵皮石斛為蘭科石斛屬植物鐵皮石斛的铁皮提新鮮或幹燥莖，其為藥食兩用植物。石斛長期以來，多糖許多東方國家將石斛用於草藥製劑中，及抗而在中國已經發現了超過60種石斛。氧化研究鐵皮石斛具有很好的活性抑製衰老、抑製腫瘤、铁皮提抗氧化、石斛提高機體免疫能力的多糖功效，並且可用於腫瘤、及抗糖尿病、氧化研究慢性咽炎胃炎、活性機體免疫下降等的铁皮提輔助治療。生物堿類、石斛多糖類、多糖菲類等物質為鐵皮石斛的主要化學成分，其中多糖是其主要有效成分且較之生物堿和菲類，多糖含量較高。
近年來，人們對多糖的功效認知逐漸增多，鐵皮石斛多糖的研究也越來越多。尚喜雨用水提法、酶法對鐵皮石斛多糖的提取進行了研究，分別得到最佳提取條件後，以最佳提取條件進行提取並比較提取得率，結果水提法的多糖平均提取率為12.07％，酶法的多糖平均提取率為20.84％。何鐵光等從鐵皮石斛原球莖中提取得到多糖DcPPla-1，並研究了DCPPla-1對羥基自由基和超氧陰離子的清除作用，發現多糖DCPPla-1對二者的清除作用均比較明顯，同時多糖DcPPla-l對由Fe2+和H202誘導的小鼠肝組織脂質過氧化具有極顯著的抑製作用(P＜0.01)。查學強等研究了鐵皮石斛多糖對超氧陰離子自由基、羥基自由基的清除作用及對烷基自由基引發的亞油酸氧化體係的抑製作用，結果表明，多糖對超氧陰離子自由基、羥基自由基具有不同程度的清除作用，對烷基自由基引發的亞油酸氧化體係有顯著的抑製作用。
本文采用正交試驗方法，確定鐵皮石斛多糖的最佳提取工藝條件。並通過測定鐵皮石斛多糖對1，1-二苯基-2-苦肼基(DPPH)、超氧陰離子(02-)、羥基自由基(-OH)的清除能力以及鐵皮石斛多糖對三價鐵的還原能力來研究其抗氧化活性。
一、材料與方法
1、實驗材料與試劑
鐵皮石斛幹燥莖由江蘇益斛生物科技有限公司提供；無水乙醇、正丁醇、氯仿、石油醚等均為分析純，DPPH、水楊酸、抗壞血酸、雙氧水、鐵氰化鉀等均為分析純化學試劑，均由天津江天化工有限公司提供。
2、實驗儀器與設備
主要儀器設備有HW-SY型電熱恒溫水浴鍋(北京市長風儀器儀表公司)；TGL-16B型台式離心機(上海安亭科學儀器廠)；RE-52AA型旋轉蒸發儀(上海亞榮生化儀器廠)；SHB-Ⅲ型循環水真空泵(鄭州長城科工貿有限公司)；LGJ-0.5型冷凍幹燥機(軍事醫學科學院實驗儀器廠)；Model680型酶標儀(ThermoElectronU.S.A)。
3、實驗方法
（1）鐵皮石斛多糖的提取
將幹燥的石斛莖粉碎，過篩。稱取10g粉末，用石油醚在80℃下回流提取3h進行脫脂，然後過濾。濾渣繼續用無水乙醇回流提取3h進行脫色，過濾並幹燥，加入適量體積倍數的蒸餾水在恒溫水浴鍋中提取多糖，得到多糖提取液，進行多次提取，提取液合並濃縮；采用Sevag試劑脫蛋白5次，然後旋蒸除去Sevag試劑；水層用去離子水透析24h，再加入4倍體積的無水乙醇沉澱；離心後，沉澱物依次用乙酸乙酯和丙酮洗滌，沉澱溶解在水中並凍幹，得到鐵皮石斛多糖。多糖得率計算公式：
多糖得率(％)=(鐵皮石斛多糖質量／鐵皮石斛粉末質量)×100
(2)單因素試驗和正交試驗
以鐵皮石斛多糖的提取得率為評價指標，考察熱水浸提中提取時間、料液比、提取溫度、提取次數四個因素對鐵皮石斛多糖提取的影響。根據單因素試驗的結果確定各個因素的水平範圍並以此進行正交試驗。
(3)鐵皮石斛多糖對DPPH清除能力的測定
根據Sllimada等的方法測定鐵皮石斛多糖的DPPH清除能力，並進行了一些修改。將多糖樣品配製成濃度梯度為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0m咖L的多糖溶液，然後準確吸取2.0mL多糖溶液加入到由鋁箔覆蓋的試管中，再分別加入0.2mmol／L的DPPH-乙醇溶液2.0mL，劇烈振蕩、混勻，避光反應30min。在517nm處測定其吸光度值，每個樣品濃度測定三組平行。同時用維生素C溶液作陽性對照。
DPPH自由基清除活性(RSA)計算公式如下：
式中：A1為DPPH-乙醇溶液和蒸餾水的吸光度值；
A2為樣品溶液和無水乙醇溶液的吸光度值；
A3為DPPH-乙醇溶液和樣品溶液的吸光度值。
（4）鐵皮石斛多糖對超氧陰離子清除能力的測定
根據查學強和王麗霞等的方法測定鐵皮石斛多糖對超氧陰離子的清除能力，並進行了部分修改。將多糖樣品配製成濃度梯度為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mg／mL的多糖溶液，將pH為8.2的50mmol／L的Tris-HCl緩衝液在25℃下預熱20min，然後吸取Tris-HCl緩衝液2.0mL和0.5mL多糖溶液混勻，立即加入1.0mL7mmo兒的鄰苯三酚溶液，迅速搖勻，在25℃下反應5min，在325nm處測定其吸光度值，每個樣品濃度測定三組平行。同時用維生素C溶液作陽性對照。
超氧陰離子清除活性(RSA)計算公式如下：
（5）鐵皮石斛多糖對羥基自由基清除能力的測定
根據smironoff和wang等提出的方法測定鐵皮石斛多糖對羥基自由基的清除能力，並加以改進。將多糖樣品配製成濃度梯度為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mg／mL的多糖溶液，然後吸取2.0mL多糖溶液與2.0mL9mmol／L的Fes04和2.0mL9mmol／L的水楊酸-乙醇溶液，混合，靜置10min，加入2.0mL8.8mm01幾的H202，在37℃下反應30min，在510nm處測定其吸光度值，每個樣品濃度測定三組平行。同時用維生素C溶液作陽性對照。
羥基自由基清除活性(RSA)計算公式如下：
式中：A1為不加樣品的溶液的吸光度值；
A2為不加水楊酸-乙醇的溶液的吸光度值；
A3為樣品溶液的吸光度值。
（6）鐵皮石斛多糖還原能力的測定
根據文獻所述方法測定鐵皮石斛多糖的還原能力，並進行一些修改。將多糖樣品配製成濃度梯度0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mg／mL的多糖溶液，將1.0mL多糖溶液、2.5mLpH為6.6的0.2mol／L磷酸鹽緩衝液、2.5mL1％鐵氰化鉀溶液混合，在50℃水浴中反應20min後加入2.5mL10％的三氯乙酸，搖勻後離心(400r／min)。吸取2.5mL上清液，然後加入2.5mL蒸餾水、6.5mL0.1％氯化鐵溶液，靜置反應10min，在700nm處測定其吸光度值，每個樣品濃度測定三組平行。同時用維生素C溶液作陽性對照。以吸光度值表示其還原能力。
二、結果與分析
1、正交試驗結果
根據單因素試驗確定的各因素水平範圍得到正交因素水平表，如表1所示。根據因素水平表進行L9(34)正交試驗，試驗結果如表2所示。正交試驗方差分析結果如表3所示。
根據表2中的R值可知RA＞RB＞RC＞RD，則四個因素對多糖提取得率影響由大到小為提取時間＞料液比＞提取溫度＞提取次數。根據K值確定各因素最佳水平，考慮到試驗所需的時間、原料等因素，確定提取次數為3次。最終得到鐵皮石斛多糖提取的最佳提取條件為A2B3C2D2，即提取時間2h，料液比1:80，提取溫度80℃，提取次數3次。由表3方差分析結果可知通過在0.05顯著水平上的檢驗，提取時間和料液比兩種因素對鐵皮石斛多糖提取得率有顯著影響。
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