2.2.6方法學考察
2.2.6.1線性回歸方程和線性範圍
空白血清稀釋混合對照品溶液(各標準品濃度均為0.25g/L)，基于藥物濃度為0.25、血清0.05、药物药材0.01、化学0.005、不地棱的含定0.001、同产0.0005g/L，入血取上述係列混合對照品血清溶液，成分按照標準處理後進行HPLC檢測並記錄色譜圖和峰麵積。量测以橫坐標(X)代表血清中藥物的基于質量濃度，縱坐標(Y)代表藥物與內標的血清峰麵積比值，計算4種成分的药物药材回歸方程和相關係數。
2.2.6.2日間精密度和日內精密度試驗
大鼠空白血清18份各100μL，化学不同質量濃度的不地棱的含定對照品溶液加入後在線性範圍內配成低(0.0005g/L)、中(0.005g/L)、同产高(0.25g/L)3種待測液各6份，按照標準處理後進行HPLC檢測並記錄色譜圖和峰麵積。每天3個劑量各測定6次，記錄峰麵積，計算日內精密度;1周內連續檢測6d，計算日間精密度。
2.2.6.3方法回收率試驗
分別配製6份低、中、高濃度的血清樣本，按照標準處理後進行HPLC檢測並記錄色譜圖和峰麵積，對照品峰麵積與內標物峰麵積的比值計算後測定質量濃度。將各成分理論的加入濃度和測定質量濃度進行比較，計算方法回收率。
2.2.6.4基質效應試驗
分別配製6份低、中、高質量濃度的血清樣本，按照標準處理後進行HPLC檢測並記錄色譜圖和峰麵積;同時配製相同濃度的以流動相為基質的對照品溶液直接進樣分析，空白血清加對照品的測定值與對照品溶液測定值之比即為基質效應，考察血漿基質幹擾情況。
2.2.6.5穩定性試驗
分別配製18份低、中、高質量濃度的血清樣本，取3種質量濃度樣品各6份，在室溫下放置4h，按照“2.2.4”項下方法處理得到待測血清樣本，每個質量濃度的血清樣本處理完成後進行HPLC檢測;取三種質量濃度的樣本各6份，－20℃條件下將含藥血漿樣本冷凍24h，室溫下再溶解，反複凍融3次後進行HPLC檢測;另將於－80℃條件將3種質量濃度的樣本各5份放置1周，待室溫溶解後進行HPLC檢測。計算3種條件下的標準偏差(ＲSD)，考察穩定性。
2.2.7統計學處理
采用SPSS19.0統計軟件進行數據分析，所有數據以均值±標準差(x±s)表示，不同組間兩兩比較采用單因素方差分析(One－wayANOVA)中的LSD法(最小顯著性法)，P＜0.05為差異有統計學意義。
2.2.8結果與分析
2.2.8.1專屬性試驗
結果如圖1所示，按照標準處理的大鼠空白血清進行HPLC檢測後，空白血清中的香草酸、對羥基苯甲酸、蘆丁及阿魏酸對照品及內標物與內源性物質的分離度良好，且沒有幹擾物質，各藥品及代謝物與內源性物質之間沒有相互作用，顯示該方法專屬性良好。
2.2.8.2線性回歸方程和線性範圍
血清中對羥基苯甲酸的回歸方程為Y=56971.00X+282.99(Ｒ2=0.9998)，在質量濃度0.0005～0.25g/L範圍內線性關係良好;香草酸的回歸方程為Y=36756.00X+247.66(Ｒ2=0.9997)，在質量濃度0.0005～0.25g/L範圍內線性關係良好;阿魏酸的回歸方程為Y=50686.00X+89.41(Ｒ2=0.9998)，在質量濃度0.0005～0.25g/L範圍內線性關係良好;蘆丁的回歸方程為Y=36349.00X+20.99(Ｒ2=0.9997)，在質量濃度0.0005～0.25g/L範圍內線性關係良好。按信噪比(S/N)為3來計算，對羥基苯甲酸、香草酸、阿魏酸、蘆丁的最低檢測限均為是0.0001g/L。
2.2.8.3回收率、精密度、穩定性和基質效應結果
計算得到各組含藥血漿樣本的方法回收率＞90%，精密度ＲSD＜10%，各組樣品穩定性均ＲSD＜10%，基質效應考察結果在89.53%～95.12%;結果顯示實驗精密度良好，穩定性及回收率均符合藥動學的要求。
2.2.9基於血清藥物化學研究不同產地三棱的血中成分測定
根據HPLC條件，對中藥三棱幹預後的大鼠血漿樣品進行測定。以給藥時間為橫坐標，以相對峰麵積為縱坐標，計算各成分的含量，結果顯示在連續給予大鼠中藥三棱7d後，於末次給藥1h後，三棱的藥效物質對羥基苯甲酸、香草酸、阿魏酸、蘆丁達到峰值。具體結果見表2。
3討論
通過對三個不同產地三棱藥材中的化學成分分析及入血成分研究，進行色譜比較，確定原型成分及代謝產物為對羥基苯甲酸、香草酸、阿魏酸、蘆丁。同時可見不同產地三棱藥材四種成分體外和入血含量各不相同。藥材提取物中對羥基苯甲酸、阿魏酸、香草酸以浙江產地較高，蘆丁以江蘇產地略高;入血成分中蘆丁、對羥基苯甲酸以安徽產地較高，阿魏酸、香草酸以江蘇產地略高。所有成分均在1h左右達到峰值。
由於各地栽培的土壤、氣候等差異，藥材提取物中有效成分含量不同，而吸收入血的成分含量也有所不同。入血成分直接決定藥效，所以給藥後取含藥血清進行分析，分析鑒定血清中移行成分，研究其藥效相關性，對確定中藥的藥效物質基礎尤為關鍵，可為建立合理的中藥質量控製模式和方法提供參考。本研究可為三棱的資源綜合利用和質量控製提供實驗依據。
聲明：本文所用圖片、文字來源《中國中醫藥科技》2020年7月第27卷第4期，版權歸原作者所有。如涉及作品內容、版權等問題，請與本網聯係
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